Dozenten:
Ort: Bibliothek des Instituts für Klinische Physiologie, CBF Haupthaus, Aufzug 17 oder 18, 5. Stock, rechts, Raum 5740
Qualifikationsziele:
Fortgeschrittene
Kenntnisse über aktuelle pathophysiologische Fragestellungen und über
klassische und moderne Methoden, mit denen diese Fragestellungen in der
aktuellen Forschung bearbeitet werden.
Inhalte:
Vorlesung:
1. Ein Blick in die
Zelle – Konfokale Laserscanning-Mikroskopie
Der Nachweis membranständiger
Tight Junction-Proteine mit molekularbiologischen Methoden erlaubt noch keine Rückschluss
auf den tatsächlichen Einbau in die Tight Junction-Barriere. Hierzu bedarf es
optischer Techniken. Ausgehend von der klassischen Licht- bzw.
Fluoreszenzmikroskopie wird die Methode der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie
(CLSM) mit Bezug auf zellbiologische Forschung präsentiert. Als Fortschritt
gegenüber der Lichtmikroskopie ermöglicht die CLSM durch „optical sectioning“
die dreidimensionale Darstellung von räumlichen Strukturen. Das Prinzip wird
anhand verschiedener baulicher Ausführungen sowie Anwendungen erläutert und
eine Einführung in die praktische Anwendung am Gerät (Zeiss LSM 510 Meta)
gegeben.
2. Anwendungsmöglichkeiten
von Fluoreszenzfarbstoffen
Die
Entwicklung und Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen schafft für die
biomedizinische Forschung eine beträchtliche Erweiterung der Untersuchungsmöglichkeiten.
Die Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen – z.B. zusammen mit spezifischen
Antikörpern, erlauben exakte Markierungen und damit präzise Lokalisierungen
von Zellbestandteilen. Fluoreszenzfarbstoffe ermöglichen die Aufklärung von
Signalübertragungen, Stoffwechselwegen und Genexpression. Ratiometrische
Fluoreszenzmessungen erlauben die quantitative Bestimmung intrazellulärer
Parameter, wie intrazellulärer Ionenkonzentrationen oder pH-Wert.
3./4. Zur Struktur-
auch die Funktionsanalyse – Elektrophysiologische Bestimmung von
Transport- und Barriereeigenschaften
Untersuchungen zur
Bildung der epithelialen Barriere durch Tight Junction-Proteine erfolgen zunächst
durch molekularbiologische (Themen 1-3 und 5) und fluoreszenzoptische Methoden
(Thema 6). Um aber zu untersuchen, was z.B. die stabile Transfektion eines Tight
Junction-Proteins für die Barriere- bzw. Poreneigenschaften des Epithels
bewirkt, bedarf es elektrophysiologischer Methoden. Neben allgemeinen Grundlagen
der Elektrophysiologie werden zwei Standardtechniken und zwei avancierte
Methoden in ihrer Anwendung dargestellt: 1. Ussing-Kammertechnik, 2. Patch
clamp-Technik (incl. Weiterentwicklungen zu automatisierten patch clamp-Systemen
z.B. zum Screening von Ionenkanalblockern), 3. Impedanzanalyse zur Messung der
vertikalen Distribution der epithelialen Leitfähigkeit, 4. Conductance scanning
zur Messung der horizontalen Distribution der epithelialen Leitfähigkeit.
5. Die Kinetik
molekularer Wechselwirkungen – Das Biacore-Verfahren
Eine aktuelle
wissenschaftliche Fragestellung ist die Bestimmung der Wechselwirkung
porenbildender und abdichtender Tight Junction-Proteine benachbarter
Epithelzellen. Die Messung der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR, surface
plasmon resonance, Biacore-Verfahren) ist eine effiziente Technik zur
Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen in Echtzeit. Einer der
Reaktanden wird auf der Oberfläche eines Sensorchips immobilisiert und ein
zweiter Reaktand strömt über die Oberfläche dieses Chips. Die
Plasmonenresonanz kann nun genutzt werden, um eine Änderung des Brechungsindex,
verursacht durch Massenänderungen an der Oberfläche des Chips, zu detektieren.
Fortlaufende Beobachtung des Signals erlaubt eine Verfolgung der Bindungskinetik
in Echtzeit. Aus den gewonnenen Daten können kinetische Parameter bestimmt
werden. Im Kurs wird eine modellhafte Anwendung durchgeführt.
6. Vom Protein zum
Gen und zurück – Grundlagen gentechnischer Verfahren
Ausgehend von einem
Protein-of-interest werden die grundlegenden Verfahren zur Identifizierung der
zugrundeliegenden genetischen Information und der Möglichkeiten zur
rekombinanten Expression beschrieben. Im Einzelnen werden hier die Herstellung
spezifischer Antikörper, das Anlegen und Screenen repräsentativer
cDNA-Bibliotheken und die Expression rekombinanter Proteine besprochen.
Grundlegende molekularbiologische und gentechnische Verfahren wie der Einsatz
von Restriktionsenzymen, Polymerase-Kettenreaktion, elektrophoretische
Verfahren, Klonierungstechniken, Transformation in pro- und eukaryontische
Wirtssysteme sowie DNA-Sequenzierung werden anhand von Beispielen erläutert.
Weiterhin werden Sicherheitsaspekte bei gentechnischen Arbeiten besprochen.
7. Ein Schalter für
Gene – Methoden zur funktionelle Analyse der Genregulation
Aus der Identifikation
der genetischen Information für ein Protein ergibt sich die Möglichkeit zur
Ermittlung der Genstruktur. Hieraus können zum Einen die Exon/Intron-Struktur
eines Gens und die damit verbundenen (alternativen) Splicing-Vorgänge bestimmt
werden. Zum Anderen sind damit die für die konstitutive und differentielle
Regulation der Genexpression wichtigen Nukleinsäuresequenzen zugänglich und können
in entsprechenden Experimenten funktionell charakterisiert werden. Es wird die
Identifizierung der stromaufwärts des Transkriptionsstartpunktes eines Genes
gelegenen „Schaltzentrale“ (Promotor und
Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen) anhand von zwei grundlegenden Verfahren
(Genome Walking, Screening genomischer Datenbanken) erläutert. Auf der
Grundlage der im ersten Teil besprochenen Techniken wird die Klonierung der
regulatorischen Sequenzen in Luziferase-Reportergenplasmide und der funktionelle
Nachweis der Promotor-Aktivität im eukaryontischen Zellkultursystem
beschrieben. Weitere Themen sind die Mutagenese putativer
Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen sowie der Nachweis der Bindung im
Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).
8. Chromas, LaserGene
und Co. – Molekularbiologische Analysesoftware in der Praxis
Die Analyse von
Sequenzdaten wird durch eine große Anzahl molekularbiologischer Analysesoftware
unterstützt. In einer Auswahl wird hier der praktische Einsatz geeigneter
Programme anhand der in den ersten beiden Teilen besprochenen Fragestellungen
erläutert. Beginnend bei der Evaluation von Rohdaten aus der Nukleinsäuresequenzierung
werden im weiteren die Möglichkeiten eines modularen Software-Paketes bei der
Analyse der Primärsequenz sowie der Planung und Dokumentation gentechnischer
Experimente besprochen.